Chromatographie des colorants du paprika-Materiel

Résultats et commentaires

Choix de l'éluant.

Bien que tous les protocoles trouvés (par exemple dans le Hatier de spécialité pour l'utilisation d'une microcolonne ) préconisent l'usage du dichlorométhane pour cette chromatographie, nous avons été déçus par les résultats obtenus avec celui-ci.
En CCM il nous donnait un RF maximal de 1/3 environ.
Sur la microcolonne la migration et la séparation des colorants étaient peu convaincantes.

Après quelques tâtonnements, nous avons opté pour un mélange de 90% d'éther de pétrole et 10% d'éthanol absolu.
On voit ci-contre une CCM obtenue en utilisant ce mélange pour l'extraction et comme éluant.
Sur la microcolonne, la migration et la séparation des différents colorants était bien visible.
Cet éluant présente cependant l'inconvénient de se conserver assez mal du fait de la grande volatilité de l'éther de pétrole : il vaut mieux le conserver dans un erlenmeyer bien bouché pendant toute la séance de TP pour éviter que sa composition ne varie trop au cours de la manipulation.

Fractions recueillies

A mon grand dépit je dois reconnaître que les élèves ont obtenu des fractions beaucoup plus vivement colorées que moi, bien que j'aie fait un certain nombre d'essais. Il est vrai qu'ils n'ont pas lésiné sur la quantité de mélange déposé sur la colonne! Merci donc à Miloud, Nicolas et Sylvain pour ces jolies couleurs (cliquez pour voir une image plus grande)....

Les fractions sont numérotées par ordre de sortie de la colonne, les dernières sorties sont à l'arrière-plan, de droite à gauche. Le volume des fractions n'est n'est pas le même pour les deux groupes mais on observe la même succession de couleurs.

Plaques CCM

(les fractions analysées ne sont pas celles photographiées)

Fractions dans l'ordre de sortie de la colonne entre deux dépôts
du mélange initial (M), à gauche et à droite, servant de référence

Au vu des CCM, la qualité de la séparation est moins bonne que ce que la différence de couleur laissait espérer, mais c'est tout à fait en accord avec le grand nombre de colorants de RF voisins visibles en CCM: la microcolonne est trop petite pour en assurer une bonne séparation.
On observe toutefois bien que l'ordre de sortie de la colonne est le même que l'ordre de migration sur la plaque:
Le colorant jaune migrant le plus haut sur la plaque se trouve essentiellement dans la fraction 2.
Le colorant donnant la tache rouge intense la plus haute sur la plaque se trouve surtout dans les fractions 3 et 4.
A partir de la fraction 5, ce colorant disparaît progressivement, l'ensemble des colorants donnant un groupe de taches en bas sur la plaque prédomine.

Spectres d'absorption des fractions (dans l'éluant)

Toutes les fractions absorbent dans le bleu, comme leur couleur le laissait prévoir. On voit bien que la longueur d'onde du maximum d'absorption et l'allure générale du spectre varie selon les fractions, et se retrouvent d'une expérience à l'autre.

Spectres d'absorption des fractions analysées ci-dessus en CCM

l.o nm	melange	f2 jaune	f4 orange-rouge	f7 orange
330		0.097	0.655	0.714
340		0.106	0.719	0.731
350		0.121	0.764	0.753
360		0.113	0.786	0.773
370		0.131	0.839	0.817
380		0.129	0.919	0.871
390		0.154	1.09	0.959
400	0.652	0.2	1.357	1.113
410	0.719	0.23	1.586	1.235
420	0.824	0.287	1.87	1.386
430	0.914	0.326	2.156	1.506
440	1.007	0.362	2.5	1.663
450	1.035	0.392	2.14	1.591
460	1.015	0.376	2.173	1.549
470	1.022	0.374	2.241	1.559
480	0.944	0.357	2.146	1.398
490	0.78	0.277	1.941	1.131
500	0.645	0.201	1.686	0.919
510	0.501	0.139	1.327	0.704
520	0.323	0.083	0.781	0.447
530	0.186	0.046	0.404	0.252
540	0.107	0.026	0.212	0.141
550	0.062	0.015	0.115	0.078

Spectres d'absorption de fractions (dans l'éluant) obtenues lors d'un autre essai

L.o nm	melange	fract2	frac3	frac4	frac5
400	0.652	0.092	1	1.217	0.569
410	0.719	0.109	1.164	1.386	0.626
420	0.824	0.143	1.402	1.624	0.706
430	0.914	0.163	1.618	1.812	0.771
440	1.007	0.184	1.849	2.081	0.841
450	1.035	0.203	1.805	1.923	0.863
460	1.015	0.188	1.837	1.953	0.831
470	1.022	0.185	1.869	2.003	0.834
480	0.944	0.178	1.734	1.853	0.761
490	0.78	0.129	1.507	1.617	0.617
500	0.645	0.081	1.256	1.376	0.509
510	0.501	0.049	0.955	1.074	0.397
520	0.323	0.027	0.605	0.695	0.26
530	0.186	0.014	0.343	0.4	0.152
540	0.107	0.007	0.193	0.228	0.088
550	0.062	0.003	0.11	0.13	0.052
560	0.034	0.001	0.059	0.071	0.03
570	0.019	0.001	0.032	0.039	0.018
580	0.011	0.001	0.018	0.022	0.011
590	0.007	0.001	0.011	0.014	0.008
600	0.005	0.001	0.007	0.01	0.006